HPLC & UHPLC Säule Applikation

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HPLC und UHPLC Säulen Applikation von Restek® - ein Überblick.

Die HPLC (ursprünglich: Hochdruckflüssigkeitschromatografie, heute: Hochleistungsflüssigkeitschromatografie) ist ein chromatografisches Trennverfahren, bei dem Substanzen aufgrund unterschiedlich starker Wechselwirkungen mit einer stationären Phase (Säule) und einem flüssigen Eluenten (mobile Phase) zeitlich verzögert einen Detektor erreichen und somit getrennt erfasst werden können. Dadurch, dass die flüssige mobile Phase mittels einer Pumpe durch ein mit festen, porösen Partikeln gefülltes Rohr (Säule) transportiert wird, entsteht ein (hoher) Rückdruck, daher der ursprüngliche Name. Es gibt zahlreiche Detektionsarten, am häufigsten werden UV-Detektion (u.a. mit Diodenarraydetektoren), Fluoreszenzdetektion und die Kopplung mit Massenspektrometern (LC/MS bzw. LC/MS/MS) eingesetzt. 
Bei der UHPLC (Ultrahochdruckflüssigkeitschromatografie bzw. Ultrahochleistungsflüssigkeitschromatografie) handelt es sich um eine spezielle Variante der HPLC, bei der Trennungen mit hoher Geschwindigkeit bzw. sehr kurzen Analysenzeiten realisiert werden
können („FAST LC“). Dazu sind besondere Anforderungen an die Geräte nötig, sie müssen sehr hohe Drücke (mittlerweile bis über 1000 bar) handhaben können und sehr schnelle Datenaufnahmeraten realisieren. Der häufig verwendete Begriff „UPLC“ (Ultra Performance LC) besagt das gleiche, ist aber ein eingetragenes Warenzeichen der Firma Waters, die die ersten UHPLC-tauglichen Geräte entwickelt hat. 
Das Herzstück von HPLC und UHPLC ist die Säule, in deren Innerem die chromatografische Trennung stattfindet. Es handelt sich dabei um „Rohre“ (meist aus Edelstahl, seltener aus Kunststoff wie z.B. PEEK), die mit der eigentlichen stationären Phase gefüllt sind. Meistens haben sie Längen von 30 bis 250 mm, Innendurchmesser von 2 bis 4.6 mm (analytische HPLC) oder 10 bis 50 mm und größer (präparative HPLC).  Als stationäre Phase dienen meist Materialien auf der Basis von Kieselgel (ausgezeichnete Druckstabilität), für spezielle Anwendungen gibt es aber auch eine Säule auf Basis verschiedener Polymere. 
Die Größe der Partikel der stationären Phase ist heutzutage meist um 3 oder 5 µm für die klassische HPLC und < 2 µm für die UHPLC, da mit kleineren Partikeln schnellere, bessere Trennungen möglich sind (dabei steigt aber der Druck entsprechend stark an). 
Eine Sonderstellung nehmen hier die Core-Shell Phasen ein (auch „Fused Core“, „Solid Core“, „SPP „Superficially Porous Particles“ genannt). Durch den speziellen Aufbau der Partikel (nur die dünne äußere Schicht ist porös und trägt zur Trennung bei, der innere Kern ist undurchlässig und dient nur als Träger) sind die Diffusionswege der Analyten kürzer, damit ist die Bandenverbreiterung reduziert und man erhält effiziente Trennungen mit sehr schmalen Peaks. Da die äußere Partikelgröße unverändert ist, bleibt auch der Rückdruck moderat und entspricht etwa dem der gewohnten vollporösen Materialien mit gleichem Durchmesser. Damit sind Core-Shell Phasen mit 2.7µm Partikelgröße (z.B. Raptor™ 2.7µm von Restek) eine sehr gute Alternative zu <2µm UHPLC-Materialien, da sie vergleichbare Trennleistung haben, aber nur den Rückdrück eines ca. 3µm großen Partikels. Außerdem verstopfen sie nicht so schnell wie sub 2µm Säule. Auch die Raptor™ Säule mit 5µm Partikeln nehmen eine Sonderstellung ein, denn sie verhalten sich äußerlich wie vollporöses 5µm Material (geringer Rückdruck, hohe Matrixkapazität), liefern aber eine Trenneffizienz und schmale Peaks wie 3µm vollporöses Material. 
Doch nun zurück zu den Phasen: Man unterscheidet bei den kieselgelbasierten Phasen grundsätzlich zwei Typen: Normalphasen und Umkehrphasen (RP-Phasen, „Reversed Phase“-Phasen). 
Bei der Normalphasenchromatografie finden polare Wechselwirkungen statt an Materialien wie Kieselgel oder seltener Aluminiumoxid, aber auch an modifiziertem Kieselgel, an das durch chemische Umsetzung Amino-, Cyano- oder Diolgruppen gebunden wurden. Als Eluenten werden bei diesem Mechanismus organische Lösemittel und -gemische eingesetzt wie z.B. n-Heptan, Cyclohexan, Chloroform/Dichlormethan oder Ethylacetat, denen zur Steigerung der Elutionskraft polare Lösemittel wie z.B. Aceton, Dioxan, Acetonitril, THF oder Alkohole (Propanol, Ethanol, Methanol) zugesetzt werden (meist nur geringe Mengen, der Hauptanteil bleibt unpolares Lösemittel). 
Die Analyten in der NP-Chromatografie sind unpolar bis mäßig polar. Die Limitierung ergibt sich durch die notwendige Löslichkeit im ziemlich unpolaren Anfangseluenten. Normalphasenchromatografie ist aufgrund des Einsatzes organischer Lösemittel nicht sehr beliebt, aber ein hervorragendes Mittel z.B. zur Isomerentrennung unpolarer Substanzen. 
Als einen Spezialfall der Normalphasenchromatografie könnte man die HILIC-Chromatografie bezeichnen. HILIC steht für „Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography“ und wird an polaren stationären Phasen durchgeführt. Entweder an den modernen Analoga der klassischen Normalphasen (z.B. Kieselgel-, Amino-, Diolphasen) oder an entsprechend modifizierten Kieselgelphasen (seltener Polymere) wie z.B. PFPP (Pentafluorphenylpropyl), Restek® IBD (eine „polar embedded phase“), zwitterionische Phasen und viele mehr.  Die Analyten sind meist hoch polar, die Eluenten meist Gemische von Acetonitril und Wasser bzw. wässrigen Puffern. Der Anfangseluent (niedrigste Elutionskraft) besteht meist aus 80-95% Acetonitril, der Rest ist Wasser bzw. Puffer. Es bildet sich an der Oberfläche der polaren Phase eine wässrige Schicht aus, in der sich die hoch polaren Analyten wohler fühlen als im daneben vorhandenen Acetonitril, wodurch die gewünschte Retention an der stationären Phase erzeugt wird. Zur Elution der Analyten wird der Acetonitrilgehalt gesenkt (z.B. langsam auf 50-60%). Ideal sind isokratische Läufe. Die Löslichkeit der polaren Analyten im Anfangseluenten mit hohem Acetonitrilgehalt ist auch hier ein limitierender Faktor. HILIC wird häufig eingesetzt, wenn polare Analyten mittels RP-Chromatografie nicht ausreichend retardiert werden können.
Die RP-Chromatografie ist der am häufigsten verwendete Mechanismus in der HPLC. Der Name „RP-“ bzw. „Reversed Phase“- oder „Umkehrphasen“-Chromatografie hat sich historisch ergeben. Als die Grenzen der Normalphasenchromatografie erreicht waren und man unpolare stationäre Phasen brauchte, begann man durch chemische Umsetzung Alkylketten ans Kieselgel zu binden. Dadurch dreht sich der Retentionsmechanismus um, deshalb Umkehrphasen- bzw. Reversed Phase Chromatografie. Die stationäre Phase ist unpolar (meist C18 oder andere Alkylketten, aber auch Phenyl, Biphenyl sowie verschiedenste Modifizierungen). Der Eluent mit der geringsten Elutionskraft ist Wasser bzw. Puffer, hohe Elutionskraft haben wassermischbare Lösemittel wie Acetonitril (AcN), Methanol (MeOH) oder Tetrahydrofuran (THF), die sich nicht nur durch ihre Elutionsstärke unterscheiden, sondern auch in der Selektivität der Wechselwirkungen, die sie mit den Analyten und der stationären Phase eingehen. Die Analyten in der RP-Chromatografie können mäßig unpolar bis polar sein, wobei hoch polare Substanzen ein Problem darstellen, weil sie oft nicht ausreichend retardiert werden können durch die doch vorherrschenden unpolaren Wechselwirkungen. 
Ein Problem der frühen RP-Phasen waren unerwünschte bzw. schlecht kontrollierbare polare Wechselwirkungen. Da es bei der Umsetzung von Kieselgel mit Alkylketten („Bonding“) schon aus rein sterischen Gründen gar nicht möglich ist, alle Silanolgruppen auf der Kieselgeloberfläche umzusetzen, bleiben immer sogenannte „Restsilanole“ übrig, hoch polare, dissoziierbare funktionelle Gruppen (Si-OH). Diese sind - bei nicht angepassten Bedingungen - unter anderem für schlechte Chromatografie (Tailing, Adsorption) von Analyten mit polaren funktionellen Gruppen (insbesondere Säuren und Basen) verantwortlich. Das sogenannte „Endcapping“ schafft Abhilfe. In einem zweiten Reaktionsschritt erfolgt eine Umsetzung der Restsilanole mit Reagenzien mit kurzem Alkylrest (z.B. Trimethylsilyl, TMS). Aber nicht nur Endcapping hilft, die Wechselwirkungen von Analyten und Restsilanolen zu unterbinden, sondern auch Abschirmung oder der Einbau von Gruppen, die ihrerseits mit den Restsilanolen wechselwirken. Wichtig ist nur, dass der Analyt nicht an die Restsilanole heran kommt. Neben Restsilanolen sind auch Verunreinigungen im Basiskieselgel (hauptsächlich Metallionen) verantwortlich für unerwünschte polare Wechselwirkungen. Deshalb basieren die modernen RP-Phasen auf hoch reinem, synthetisch hergestelltem Kieselgel („Type B Silica“). Durch das Ausschalten unerwünschter bzw. unkontrollierbarer polarer Wechselwirkungen basiert der Trennmechanismus moderner Alkyl- RP-Säule (z.B. C18-Säule) nur noch auf hydrophoben Wechselwirkungen (van der Waals-Wechselwirkungen bzw. Londonsche Dispersionskräfte). Schön für ausreichend hydrophobe Substanzen, ganz schlecht für polarere Moleküle sowie sehr ähnliche Analyten und Isomere. Zu deren Retention und Trennung sind polare Wechselwirkungen notwendig. Aus diesem Grund gibt es mittlerweile eine Vielzahl von modernen polar modifizierten RP-Phasen. Für solche Trennungen ist Selektivität gefragt, d.h. die Phasen müssen gezielte polare Wechselwirkungen mit den Analyten eingehen können. Aus diesem Grund hat Restek® schon vor Jahren das USLC-Konzept entwickelt (Ultra Selektive Flüssigkeitschromatografie), bei dem neben rein hydrophoben C18-Phasen alternative Selektivitäten mit gezielten polaren Wechselwirkungen zur Verfügung stehen, z.B. Aqueous C18-Säule (stark hydrophob plus intensive Wasserstoffbrückenbindungen), IBD-Säule (medium hydrohob, sehr intensive Wasserstoffbrückenbindungen und deutliche Dipolwechselwirkungen), PFPP-Säule (Pentafluorphenylpropyl, wenig hydrophob, deutliche Wasserstoffbrückenbindungen, starke Dipol- und π-Wechselwirkungen, ausgeprägte elektrostatische Anziehung von Kationen) und Biphenyl-Säule (hydrophob mit sehr intensiven π-Wechselwirkungen, ideal für alles Ungesättigte und Aromaten).
Die Vergleichbarkeit von Säulen ist ein Problem in der HPLC. Auch wenn nominell das gleiche drin steckt, z.B. C18, können sich die Eigenschaften und die resultierenden Chromatogramme doch sehr stark unterscheiden. Vorhersagen über Trennungen sind in der HPLC schwierig. Ideal ist, wenn man sich an bestehenden Applikationen (z.B. aus der Literatur oder von Herstellern) orientieren kann, aber oft muss man eine Säule zuerst einmal im eigenen Labor testen. Für diesen Fall stellt die Restek® GmbH sehr unbürokratisch Testsäulen zur Verfügung und unterstützt mit vielen Beispielapplikationen (Application Database). 
Restek® ist nicht nur Lieferant, sondern bietet als Säulenhersteller eine breite Palette von Säulen für HPLC und UHPLC (bzw. UPLC®) an, die in den unterschiedlichsten Branchen im Einsatz sind (z.B. Umweltanalytik, Getränke- und Lebensmittelanalytik, chemische Industrie, klinische, toxikologische und forensische Analytik (bzw. Rechtsmedizin), Bioanalytik, Pharmazeutische Analytik). 
Die oben erwähnten Selektivitäten und Funktionalitäten gibt es größtenteils auf unterschiedlichen Basismaterialien, z.B. Allure® (anwendungsspezifische Phasen wie z.B. Allure® AK für Aldehyde und Ketone oder Allure® Organic Acids für Organische Säuren), Pinnacle® DB (1.9µm für die UHPLC, 3 und 5µm für die klassische HPLC, aber auch Spezialphasen für die PAK-Analytik (engl. PAH)), Ultra (moderne, auf hoch reinem Kieselgel Type B basierende Säulenreihe, 3 und 5µm, breiteste Palette an Selektivitäten), Raptor™ (extrem robuste Core-Shell Phasen, 2.7 und 5µm, für lange Standzeiten und hohen Durchsatz, zur Optimierung von HPLC-Methoden (schneller, bessere Trennleistung) und UHPLC/UPLC®-Methoden (vergleichbare Trennleistung, aber bessere Robustheit und Säulenstandzeiten) und schließlich Viva (300Å-Materialien für größere Moleküle z.B. Peptide und kleine Proteine).